防疫攻堅(jiān)——細(xì)說試劑盒和抗病毒藥物研發(fā)中的化學(xué)反應(yīng)
自新型冠狀病毒引發(fā)的肺炎疫情暴發(fā)以來,，關(guān)于病毒檢測和治療方面的一些科學(xué)內(nèi)容迅速引發(fā)關(guān)注。除了醫(yī)學(xué)相關(guān)的知識,，最讓人牽掛的應(yīng)該就是關(guān)于病毒檢測和抗病毒藥物方面的知識了,。前者決定了患者是否能夠確診，后者意味著我們能否更加有效地治療疾病,。在病毒檢測和抗病毒藥物方面,，化學(xué)工業(yè)的相關(guān)技術(shù)起著舉足輕重的作用，體現(xiàn)在藥理研究,、分子設(shè)計(jì),、藥物合成等很多方面。
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研發(fā)思路是阻斷病毒復(fù)制
在介紹病毒檢測和抗病毒藥物之前,，我們首先來簡單的介紹我們的技術(shù)應(yīng)用對象——病毒,。
如果您完整接受了中學(xué)教育，您應(yīng)該會對病毒有一個基本認(rèn)識,。病毒是由一個核酸分子與蛋白質(zhì)構(gòu)成的非細(xì)胞形態(tài),，它們無法自行表現(xiàn)出生命現(xiàn)象，是介于生命體及非生命體之間的有機(jī)物種,，既不是生物亦不是非生物,。
病毒由兩到三個部分組成：所有病毒都含有遺傳物質(zhì)——核酸(RNA或DNA)，多數(shù)病毒有由蛋白質(zhì)形成的衣殼,，用來包裹和保護(hù)其中的遺傳物質(zhì),。此外，部分病毒在到達(dá)細(xì)胞表面時能夠形成脂質(zhì)包膜環(huán)繞在外,，本次的新型冠狀病毒2019-nCoV就是如此,。病毒的形態(tài)各異，從簡單的螺旋和正二十面體到復(fù)合型結(jié)構(gòu)均存在,，顆粒大小大約是100納米左右,。
我們知道，一切生物的遺傳信息都儲存在核酸上,。對于一般的生物細(xì)胞,，遺傳信息的表達(dá)是一個頗為復(fù)雜卻極度高效的生物化學(xué)過程,。以真核細(xì)胞為例，儲存在DNA上的遺傳信息(表現(xiàn)為構(gòu)成DNA的堿基對的特定排列方式)通過RNA轉(zhuǎn)錄,，再由RNA轉(zhuǎn)譯,，合成特定的蛋白質(zhì),，從而得以進(jìn)行特定的生命活動,。而對于病毒來說，它必須借助侵入的特定細(xì)胞,，利用這個細(xì)胞(稱為宿主細(xì)胞)的現(xiàn)有工具進(jìn)行自身遺傳信息的復(fù)制和轉(zhuǎn)譯,，從而繼續(xù)傳播。
相對于一般的真核細(xì)胞,，病毒的遺傳信息十分簡單,，但復(fù)制和轉(zhuǎn)譯方式多樣。對于病毒的檢測者來說,，只要能夠?qū)⒉《緩沫h(huán)境中分離出來,，對其遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測，就可以判斷是何種病毒了,，這是病毒檢測的思路,。另外，如果我們能夠阻斷病毒的復(fù)制過程,，我們就能阻斷病毒在體內(nèi)的傳播,，進(jìn)而治療疾病，這是抗病毒藥物研發(fā)的思路,。
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病毒復(fù)制機(jī)制,。(資料圖)
試劑盒需要聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)
關(guān)于本次2019-nCoV病毒檢測，如果您關(guān)注新聞,，您可能會了解到試劑盒這個“神器”的存在,。有了試劑盒，我們就可以在極短時間內(nèi)確診病例,，如果試劑盒不夠用,，整個新型冠狀病毒肺炎的確診都成問題。
不過,，您有沒有思考過這么一個問題,，試劑盒為什么能夠在短時間內(nèi)發(fā)現(xiàn)病毒，從而確診呢?我們前面已經(jīng)提到,，生物遺傳信息的表達(dá)方式十分復(fù)雜,，速度也并不算很快?？墒?，傳染病的防治要求醫(yī)務(wù)工作者以最快的速度發(fā)現(xiàn)病例,，并對確診患者進(jìn)行隔離和治療，這個矛盾是如何解決的呢?
原來,，目前抗擊新型冠狀病毒肺炎的試劑盒,，主要是利用RT-PCR技術(shù)，即Reverse Transcription-Polymerase chain reaction,。翻譯成中文,，叫做逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是生物化學(xué)領(lǐng)域非常重要,，且廣受認(rèn)可的一項(xiàng)應(yīng)用技術(shù),，而RT-PCR技術(shù)是PCR技術(shù)在RNA病毒檢測方面的衍生。
我們首先來介紹一下PCR,。在沒有PCR的時代,，科學(xué)家是如何復(fù)制生物基因的呢?首先，將DNA經(jīng)限制酶剪裁,，再利用連接酶加到運(yùn)載體中,，之后利用瞬間電擊或是熱休克的方式，送到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,，將此菌于培養(yǎng)皿大量繁殖培養(yǎng),，再經(jīng)過繁復(fù)的分離、純化過程,，時間通常需要近一周,，才能大量復(fù)制片段?？梢韵胂?，如果使用這種方法確診傳染病會是什么結(jié)果。
1986年,，美國生物化學(xué)家凱利·穆利斯發(fā)明了PCR,，他也因此獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎。穆利斯利用DNA聚合酶來擴(kuò)增特定的DNA片段,。在中學(xué)階段,，我們就知道，DNA聚合酶天然存在于生物體內(nèi),，當(dāng)DNA開始復(fù)制時,，解旋酶將雙股的DNA分開成兩個單股，DNA聚合酶便結(jié)合在兩DNA單股鏈上,，生成互補(bǔ)鏈,。在穆利斯最初的PCR中，他將雙鏈DNA加熱到96℃,，使得雙鏈分離,，再加入DNA聚合酶,，以在生物體外獲得新的DNA鏈，但由于反應(yīng)在高溫下進(jìn)行,，效率不高,。后來，嗜熱細(xì)菌水生棲熱菌體內(nèi)產(chǎn)生的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn),，提高了PCR的效率,。由于嗜熱細(xì)菌生活在溫度達(dá)到50℃~80℃的間歇泉中，其DNA聚合酶具有耐熱性,。在用于PCR時,，高溫并不能破壞這種DNA聚合酶,，PCR由此變得簡單并且可以由機(jī)器操作,，大大減小了核酸檢測的難度。不但如此,，現(xiàn)在一些廠商利用蛋白質(zhì)的模擬分析,，將DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行人工修改，還可以合成出性能遠(yuǎn)超原本自然提取而來的酶,。
對于PCR來說,，高效的DNA聚合酶和DNA模板是必需的，當(dāng)然還有其他必需成分,，如引物和緩沖劑,。但對于2019-nCoV這樣的RNA病毒來說，我們復(fù)制的樣本并不是DNA而是RNA,，這是就需要將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA),，再進(jìn)入DNA擴(kuò)增。RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù),，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA,。目前，這個技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病的診斷,，除目前的2019-nCoV,，還有艾滋病病毒、埃博拉病毒,、流感病毒,、丙肝病毒以及麻疹病毒等，都可以用RT-PCR進(jìn)行檢測,。
本次2019-nCoV病毒檢測,，一般只需要4~6小時，即可對咽拭子樣本獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果,。目前,，隨著相關(guān)企業(yè)的不斷研發(fā),，已有1~2小時即可出結(jié)果的檢測試劑盒出現(xiàn)。不過,，RT-PCR有一定的漏診情況,，即使多次檢測，也可能會有假陰性結(jié)果出現(xiàn),，需要注意,。
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新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。(資料圖)
藥物研發(fā)依賴化學(xué)合成
除了檢測試劑,，對于新型冠狀病毒肺炎,，人們更加關(guān)心的是如何從根本上治愈疾病。不過,，截止到發(fā)稿時,，還沒有官方發(fā)布的特效藥物出現(xiàn)。不過,，由于醫(yī)學(xué)界已經(jīng)對RNA病毒的傳播和感染機(jī)制有所認(rèn)識,，目前，研究人員正在對現(xiàn)有抗病毒藥物進(jìn)行篩選,。
抗病毒藥物是藥物家族中非常重要的一支,。我們知道，藥物與化學(xué)密不可分,，目前市面上銷售的絕大部分西藥都是化學(xué)合成的,，早期的藥物化學(xué)發(fā)展史幾乎等同于有機(jī)化學(xué)發(fā)展史，有機(jī)化學(xué)工業(yè)最初的產(chǎn)品幾乎都是藥物,。隨著化學(xué)和醫(yī)學(xué)水平的不斷發(fā)展,，藥物的結(jié)構(gòu)越來越復(fù)雜，功能越來越明確,。到上世紀(jì)40年代,，抗生素的問世，使人類對于細(xì)菌這一病原體也有了強(qiáng)力藥物,。不過,，對于另外一個重要的病原體——病毒，抗病毒藥物的發(fā)展卻晚了一些,。
抗病毒藥物是一類用于特異性治療病毒感染的藥物,，類似于抗生素治療細(xì)菌感染一樣，特定的抗病毒藥物對特定的病毒起作用,。但抗病毒藥物和抗生素不同的是,，后者消滅細(xì)菌，前者只是抑制病毒的發(fā)展,。它與我們在本系列科普中提到的消毒劑不同點(diǎn)在于,，抗病毒藥物抑制體內(nèi)的病毒,，而后者是用于消滅體外的病毒。
抗病毒藥物的機(jī)理主要是通過影響干擾病毒復(fù)制周期的某個環(huán)節(jié)來實(shí)現(xiàn)抵抗病毒,，包括但不限于直接抑制或殺滅病毒,、干擾病毒吸附、阻止病毒穿入細(xì)胞,、抑制病毒生物合成,、抑制病毒釋放或增強(qiáng)宿主抗病毒能力等。目前,，市面上能看到的大多數(shù)的抗病毒藥物是用于對抗艾滋病毒,、皰疹病毒、乙型肝炎病毒,、丙型肝炎病毒,、甲型流感病毒和乙型流感病毒等。
與發(fā)展超過70年的抗生素相比,，抗病毒藥物還是個“晚輩”,。但過去的40年間，抗病毒藥物的發(fā)展非常迅速,。其中，艾滋病的不斷蔓延推動了對抗病毒藥物的需求,，而抗艾滋病毒藥物阿昔洛韋的面世,，成為了抗病毒藥物發(fā)展的里程碑。
上世紀(jì)70年代,，艾滋病在世界上迅猛傳播,。面對不斷蔓延的艾滋病疫情，化學(xué)家開始從核苷類似物尋找抗病毒的良藥,?；瘜W(xué)家發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病毒復(fù)制時,，核苷類似物可以被相關(guān)酶當(dāng)作核苷并用于合成其基因組,，而這些類似物缺少與磷相連能夠相互連接形成DNA骨架的羥基，會造成DNA的鏈終止,，從而抑制病毒的增殖,。阿昔洛韋問世。作為一種核苷類似物,，它最大的特異功能就在于可以抑制病毒用于編碼的胸苷激酶和DNA聚合酶,，能顯著地抑制感染細(xì)胞中病毒DNA的合成，而不影響非感染細(xì)胞的DNA復(fù)制,。它的發(fā)明者,，美國生物化學(xué)家格特魯?shù)?middot;埃利恩也因此獲得了1988年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎,。正是在一代代生物化學(xué)家和醫(yī)學(xué)家的努力下，在得到妥善治療的前提下,，艾滋病感染者的預(yù)期生存期已得到很大程度的延長,。根據(jù)估計(jì)，如果一個20歲的青年人在1996年患上艾滋病,，他只能活到大約39歲,。如果一個同樣的20歲青年在2011年患上艾滋病，他可以活到大約70歲,。
目前,，抗病毒藥物共有六大類，即穿入和脫殼抑制劑,、DNA多聚酶抑制劑,、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白質(zhì)抑制劑,、神經(jīng)氨酸酶抑制劑和廣譜抗病毒藥,。
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治療用藥正在試驗(yàn)
在《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》中，在抗病毒治療方面,，寫道：目前沒有確認(rèn)有效的抗病毒治療方法,。可試用α-干擾素霧化吸入(成人每次500萬U或相當(dāng)劑量,，加入滅菌注射用水2ml,，每日2次)、洛匹那韋/利托那韋(200mg/50mg,，每粒)每次2粒,，每日2次，或可加用利巴韋林靜脈注射(成人每次500mg,，每日2次),。要注意洛匹那韋/利托那韋相關(guān)腹瀉、惡心,、嘔吐,、肝功能損害等不良反應(yīng)，同時要注意和其他藥物的相互作用,。而據(jù)國家衛(wèi)計(jì)委透露,，目前阿比多而和瑞德西韋也在進(jìn)行試驗(yàn)。下面,，我們來簡要介紹一下阿比多爾,、洛匹那韋/利托那韋和瑞德西韋三種藥物。
阿比多爾：阿比多爾是前蘇聯(lián)藥物化學(xué)研究中心研制的非核苷類抗病毒藥物，于1993年在俄羅斯首次上市,，目前主要在俄羅斯和中國用于流感的治療,。相對于常見抗流感藥物奧司他韋，阿比多爾合成簡單且廉價,，而其抗流感病毒的臨床證據(jù)就相對不足,。
這一次在新型冠狀病毒的治療中，我們在《武漢協(xié)和醫(yī)院處置2019新型冠狀病毒感染策略及說明》中也看到了它的身影,，但目前并沒有確切的證據(jù)證明阿比多爾對于新型冠狀病毒的治療有效,。武漢協(xié)和醫(yī)院的那份指南后來也漸漸被新的更好的方案替代。
洛匹那韋/利托那韋：洛匹那韋是一種新的抗HIV的蛋白酶類抑制藥物,，主要通過阻斷Gag-Pol聚蛋白的分裂,，產(chǎn)生未成熟的、無感染力的病毒顆粒而發(fā)揮抗HIV病毒的作用,。LPV主要由肝細(xì)胞色素P450系統(tǒng)廣泛代謝,，且?guī)缀鯇ｉT由CYP3A同工酶代謝。而利托那韋不僅是一種蛋白酶抑制劑,，還是一個強(qiáng)效的CYP3A酶抑制劑,，可抑制洛匹那韋在體內(nèi)的藥物代謝，從而提高洛匹那韋在血漿中的藥物濃度,，增強(qiáng)抗病毒作用,。所以，臨床上通常是把洛匹那韋和低劑量利托那韋聯(lián)合使用,，這種復(fù)方制劑,，商品名叫克立芝，于2000年被美國FDA批準(zhǔn)上市,。本次疫情，這個藥首先被大眾所了解,，是因?yàn)楸贝蟮谝会t(yī)院呼吸和危重癥醫(yī)學(xué)科主任王廣發(fā)居家隔離時自稱用了這個藥進(jìn)行治療最后痊愈,，泰國的痊愈案例，很可能也是使用了克立芝,。
這個藥一度給本次疫情帶來希望,，但是目前沒有證據(jù)證明克立芝在臨床中有效，目前的報道都是零星的案例,，不具備代表性,。細(xì)胞學(xué)和動物學(xué)研究表明，克立芝的抗冠狀病毒作用和肺部保護(hù)能力不如瑞德西韋,。
瑞德西韋：瑞德西韋是一個作用于“依賴RNA的RNA合成酶(RdRp)”的廣譜抗病毒藥物,，是由吉利德開發(fā)的一種新型實(shí)驗(yàn)性廣譜抗病毒藥物，用于治療埃博拉病毒,。據(jù)近期的一項(xiàng)研究顯示,，瑞德西韋和干擾素IFNb1-b的聯(lián)合用藥對MERS有顯著療效,。目前，該藥正在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn),。
不過,，瑞德西韋的開發(fā)者吉利德公司也發(fā)表聲明說：瑞德西韋尚未在任何國家獲得批準(zhǔn)上市，其安全性和有效性也未被證實(shí),。
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來源：中國化工報
